近日，Bioresource Technology在线发表了糖化学与生物技术教育部重点实验室刘龙教授课题组的研究成果“Engineering diacetylchitobiose deacetylase fromPyrococcus horikoshiitowards an efficient glucosamine production” (Huang et al., Bioresource Technology. 2021.334: 125241)。江南大学2020级博士后黄子洋为论文第一作者，刘龙教授为通讯作者，论文作者还包括吕雪芹助理研究员、刘延峰研究员、李江华教授和堵国成教授。

氨基葡萄糖（Glucosamine, GlcN）是一种天然的水溶性单糖，能修复和保护软骨组织，刺激软骨细胞生长，促进软骨形成。传统制备GlcN的方法是从蟹壳和虾壳中提取几丁质和壳聚糖进行酸水解，水解过程需要的浓酸等会对环境产生严重污染。因此，通过生物催化的方法以N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine, GlcNAc）为底物制备GlcN因其原料丰富且环境友好而受到广泛关注。

几丁二糖脱乙酰酶（Diacetylchitobiose deacetylase, Dac）是一种对GlcNAc2和GlcNAc单体都具有脱乙酰活性的几丁质脱乙酰酶。来源于Pyrococcus horikoshii的PhDac最适温度为75°C，最适pH值为7.0-8.0，但GlcN在酸性条件下才能保持稳定（pH低于4.8），且高温会加速GlcN的降解。因此，为了保证GlcN的稳定性，目前催化过程中选用的温度和pH（40°C，pH 8.0）严重制约了PhDac的催化效率。

为了解决上述问题，江南大学生物工程学院生物系统与生物加工工程研究室研究人员结合PhDac的分子结构模型，利用计算机软件对PhDac和底物GlcNAc进行分子对接。基于分子对接得到的9个可能的底物结合位点，通过丙氨酸扫描和定点饱和突变筛选到一个酶活较好的突变体M14，比酶活达到5162.17 U/mg，与野生型相比提高了70.02%。通过动力学分析发现，M14的k_cat/K_m值是野生型的2.21倍，说明该突变体的催化效率得到了显著提高。同时，为了进一步提高反应过程中GlcN的稳定性，利用Rosetta supercharge软件设计PhDac的电荷，经过计算机预测，得到23个可能影响最适pH的氨基酸位点。然后，分别在M14的基础上将这23个位点突变成Glu或Asp。经过一系列筛选和验证，得到了6个对最适pH影响较大的氨基酸位点，并对这6个位点进行组合突变得到了一个最适pH显著降低的突变体M20。该突变体的最适pH值降至6.0，且在pH 5.5时仍保持较高的催化活性，最高比活性达到6277.28 U/mg，约是野生型的2倍。同时，pH6.0的反应条件下，GlcN的稳定性显著提高，转化率达到94.3%。

上述研究工作得到了国家自然科学基金（32021005, 31870069）、国家重点研发计划（2018YFA0900300）、中央高校基本科研专项资金（JUSRP52019A, JUSRP121010, JUSRP221013，JUSRP51713B）和山东省重点研发计划（重大科技创新项目）（2019JZZY011002）的资助。

图1. GlcNAc-PhDac结合位点的结构特征和关键氨基酸残基

图2.通过半理性改造提高PhDac的催化效率

图3.最适pH相关氨基酸残基的预测和筛选

图4.通过半理性改造降低PhDac的最适pH

图5.不同反应温度和pH下GlcN的合成情况分析

图6.整个培养过程中细胞生长情况和PhDac酶活性情况分析